PAGE膠蛋白微量回收試劑盒（貨號：RTD8108）       

● 試劑盒組成：

● 運輸、儲存條件和效期：

常溫運輸，標簽溫度保存，有效期為一年。

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介及使用說(shuō)明：

蛋白電泳不僅可用于檢測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，而且也是分離純化蛋白質(zhì)的重要工具之一，隨著(zhù)蛋白質(zhì)技術(shù)的微量化，有必要從凝膠中回收蛋白質(zhì)以用于制備抗體、免疫印跡、氨基酸組分分析或末端序列測定等，本產(chǎn)品就是專(zhuān)門(mén)為此用途開(kāi)發(fā)的微量蛋白膠回收法，回收效率在50-80%。

按照每次使用400 μl 溶液A計算，試劑盒至少可以使用20 次。

● 使用方法：

1. 電泳：

按常規方法進(jìn)行變性（SDS-PAGE）或非變性蛋白電泳（Native-PAGE）。

2. 切膠：

2.1 用手術(shù)刀片將銅染（貨號：RTD6207）或鋅染（貨號：RTD6206）的膠塊中含有目的條帶的部分膠切下（盡可能地把多余的膠切除，否則會(huì )影響回收效率），放入1.5 ml的離心管中，用相應的消除液將膠中蛋白質(zhì)條帶脫色到膠體接近無(wú)色透明，超純水漂洗凝膠兩次，保留膠體進(jìn)行步驟3。

2.2 由于考馬斯亮藍染色蛋白的特殊性，不建議考染后進(jìn)行切膠操作。建議把樣品分多孔上樣，電泳后只切其中一個(gè)膠孔的膠條進(jìn)行染色，然后將此膠條放回到在整體膠中原來(lái)的位置，通過(guò)顯色膠條上的蛋白條帶找到在未染色膠上對應區域，并切下膠體進(jìn)行步驟3。

2.3 如不進(jìn)行染色，可以使用預染Marker判斷目的蛋白的位置進(jìn)行切膠進(jìn)行步驟3。但此方法缺點(diǎn)在于蛋白的位置難以精確判斷。

3. 研磨處理：

3.1 稱(chēng)取1.5 ml離心管中膠塊重量；用研磨杵充分將膠塊壓磨成盡可能細小的碎片。

3.2 即用型溶液A配制：

    根據溶液A的使用量配制即用型溶液A的體積。配制比例為：1 ml溶液A加入10 μl 1 M DTT溶液。

3.3根據膠塊重量加入即用型溶液A，用研磨杵再次充分研磨，4℃搖床慢搖洗脫過(guò)夜（12-16小時(shí)）。

注：膠塊重量和即用型溶液A體積大體按照1:4比例加入，如膠塊100 mg加入400 μl即用型溶液A，溶液A使用量寧多勿少。洗脫時(shí)間與凝膠濃度，蛋白分子量大小有關(guān)，膠濃度越高，分子量越大，洗脫時(shí)間越長(cháng)。

4. 過(guò)濾除膠：

用1 ml 的去尖吸頭吸取混合物至過(guò)濾柱中（過(guò)濾柱放入收集管中），注意將碎膠一起吸入，溶液過(guò)多時(shí)可分次加入，12,000 rpm 離心2分鐘，保留收集管中的濾出液（包含蛋白）。

5. 蛋白沉淀：

     5.1 將濾出液轉移到1.5 ml離心管中，加入1/10體積的溶液B-助沉液，混勻，常溫放置15 min。

     5.2 加入步驟5.1溶液1/4體積的溶液C-沉淀液，充分混勻后，冰浴15 min。

         注：加入溶液C后溶液變渾濁，需要徹底充分混勻。

5.3  4℃ 12,000 rpm離心10分鐘，去除上清，保留蛋白沉淀。

   注：由于溶液B-助沉液的作用，此步驟得到管底很明顯的蛋白沉淀物。

6. 蛋白漂洗：

6.1 蛋白沉淀中加入1 ml預冷的丙酮（自備，試劑盒不提供），徹底重懸沉淀，混勻，冰浴放置15 min。

6.2 4℃ 12,000 rpm離心10分鐘，去除上清，保留沉淀。

    注：通過(guò)丙酮的漂洗，去除步驟5.3中蛋白沉淀中的非蛋白組份。

6.3 離心管快甩離心，用10 μl吸頭將離心管中殘余溶液徹底吸凈，常溫開(kāi)口風(fēng)干1-2分鐘，待殘留的液體揮發(fā)干凈。

7. 蛋白貯存：

實(shí)驗示例：