His標簽蛋白純化試劑盒

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

His標簽蛋白純化試劑盒（His-tag Protein Purification Kit）也稱(chēng)為鎳柱試劑盒，采用NTA His-tag 純化樹(shù)脂可以兼容高濃度變性劑(8M尿素或6M鹽酸胍)，能夠簡(jiǎn)單、快速、靈活、高效并且高特異性地在非變性或變性條件下純化His標簽蛋白。純化原理：通常帶有6個(gè)組氨酸標簽的重組蛋白(6X His-tagged recombinant protein)或帶有6個(gè)以上連續組氨酸標簽的重組蛋白，被稱(chēng)為His標簽蛋白。蛋白樣品溶液通過(guò)NTA His-tag 純化樹(shù)脂時(shí)，重組蛋白His標簽上的組氨酸殘基能特異性地結合到樹(shù)脂中的鎳離子上，其它蛋白則不能被結合。洗滌后，His標簽重組蛋白被洗脫，從而被分離純化。

試劑盒配套的NTA His-tag 純化樹(shù)脂采用高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠(Sepharose CL-6B)為基質(zhì)，并使用了進(jìn)一步優(yōu)化的連接臂和鎳離子螯合技術(shù)，非特異性蛋白結合顯著(zhù)降低，耐受壓力強，鎳離子螯合非常穩定。具體參數如下：

本試劑盒用途廣泛，可以用于在非變性條件和變性條件下純化His標簽蛋白。試劑盒配套有蛋白純化柱，只需通過(guò)離心即可完成His標簽蛋白的結合、漂洗及洗脫步驟，方便快捷。

按照每次收集2 ml細菌沉淀，每次使用50 μl NTA His-tag樹(shù)脂純化，參考本說(shuō)明書(shū)本試劑盒足夠進(jìn)行20次的小量His 標簽蛋白純化。每次蛋白(~55kD)的最大純化量為0.5-1 mg。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存，至少一年有效;試劑盒常溫運輸。

● 產(chǎn)品組成：

● 使用說(shuō)明：

一. 大腸桿菌中His標簽重組蛋白的誘導表達：

1.1 挑取含His標簽重組蛋白的單克隆，接種到10 ml相應抗生素的LB培養液中，培養過(guò)夜。

1.2 按照1:20的比例取培養過(guò)夜的菌液，接種到含相應抗生素的LB培養液中。例如取1ml培養過(guò)夜的菌液接種到20ml含適當抗生素的LB培養液中。

1.3 37℃常規培養約30-60 min或更長(cháng)時(shí)間，至菌液的OD₆₀₀達到0.6。

   注:OD值非常重要，0.6為細菌生長(cháng)的對數期。

1.4 加入IPTG至終濃度為0.4-1 mM，適當溫度繼續培養4-5小時(shí)。

注：加入IPTG前留取1 ml菌液作為未誘導的對照。對于特定蛋白的誘導表達，最佳的IPTG濃度、誘導溫度、和誘導時(shí)間需要通過(guò)實(shí)驗確定。

1.5 取2 ml菌液加入到2 ml離心管中，4℃ 13,000 g離心1min，棄上清，收集菌液沉淀。隨后即可進(jìn)入細菌裂解步驟。

注：菌液沉淀也可以在-80oC凍存備用。冷凍保存的菌體使用前需置于冰上解凍15 min。

二. His標簽蛋白的小量純化：

2.1 裂解：

接步驟1.5，細菌沉淀中加入100 μl 非變性裂解液/變性裂解液，將細菌沉淀充分重懸于裂解液中，可進(jìn)行輕微的漩渦混勻(盡量避免產(chǎn)生氣泡)。

a 裂解液的使用量：

根據His標簽重組蛋白表達的豐度，菌液和裂解液的體積比可以在25:1-5:1范圍內適當調整。表達豐度非常高時(shí)，每毫升菌液沉淀可以加入200 μl裂解液；表達豐度非常低時(shí)，每毫升菌液沉淀可以加入40 μl裂解液。

b 非變性裂解液和變性裂解液的選擇：

多數情況下應優(yōu)先選擇非變性條件進(jìn)行目的蛋白的裂解，因為此條件下得到的純化蛋白是有活性的。如果發(fā)現非變性條件目的蛋白的裂解效果欠佳，但目的蛋白的表達量能達到預期時(shí)，首先宜考慮調整目的蛋白的誘導表達條件，例如調整IPTG等誘導劑的濃度和誘導時(shí)的溫度等。如果調整誘導條件后在非變性條件下仍然裂解效果欠佳，此時(shí)再考慮選擇變性條件進(jìn)行裂解、洗滌和洗脫。變性條件下使用尿素作為變性劑，樣品溶解性好，洗脫樣品無(wú)需透析可以直接PAGE檢測，最終純化獲得的目的蛋白可以通過(guò)透析去除尿素后復性得到有活性的蛋白。

2.2 可選步驟：

加入終濃度1 mM PMSF或蛋白酶抑制劑混合物，混勻。

    注:蛋白酶抑制劑能防止蛋白降解。

2.3 酶解：

加入終濃度1 mg/ml溶菌酶并輕輕混勻，盡量避免產(chǎn)生氣泡，冰水浴或冰上放置30min。

注：溶菌酶根據標簽指示用滅菌水配制成100 mg/ml的母液，現用現加。溶菌酶配制成母液后，可以適當分裝后-20℃保存。

2.4超聲：

冰上超聲裂解細菌。超聲功率200-300 W，每次超聲處理10 s，每次間隔10 s，共超聲處理6-10次。具體超聲處理的方式須根據特定型號的超聲儀器自行摸索和優(yōu)化。

注：此步驟非常重要，如果超聲不徹底，His標簽蛋白不能有效釋放，會(huì )導致大量目的蛋白在步驟2.5離心后會(huì )留在沉淀中，導致蛋白純化效率大大降低。

2.5 離心得到上清：

4℃ 13000 rpm 離心10 min，收集上清至1.5ml離心管中，取10 μl上清留樣作后續檢測用。待純化的His標簽蛋白即在上清中。

2.6 蛋白純化柱裝配：

2.6.1 蛋白純化空柱（純化空柱放入2 ml收集管中）中加入50 μl NTA His-tag樹(shù)脂，旋緊蓋子，擰掉柱子底部的連接。4℃ 2000 rpm 1分鐘，棄收集管內溶液。

注：轉速不要高于2000 rm，高轉速容易損傷樹(shù)脂。

2.6.2 純化柱中加入500 μl非變性裂解液/變性裂解液，旋緊蓋子，4℃ 2000 rpm 1分鐘，棄收集管內溶液；

2.6.3 重復2.6.2步驟一次。

注：此兩個(gè)步驟是用緩沖液平衡樹(shù)脂，可以有效提高蛋白純化效率。

2.7 樹(shù)脂螯合His標簽蛋白：

2.7.1將紅色堵頭安裝在純化柱下端突起上，純化柱中加入步驟2.5得到的上清（約80-90 μl），旋緊蓋子。4℃ 搖床搖動(dòng)30分鐘，使蛋白和樹(shù)脂充分結合。

注：樹(shù)脂和蛋白結合可以混合更長(cháng)時(shí)間，可以過(guò)夜處理。

2.7.2 拔掉紅色堵頭，將純化柱放入2 ml收集管中，旋緊蓋子，4℃ 2000 rpm 1分鐘。

注：建議保留流穿液待檢，檢測樹(shù)脂的結合能力。

2.8 漂洗：

2.8.1 純化柱內加入500 μl 非變性漂洗液/變性漂洗液，4℃ 2000 rpm 1分鐘，棄收集管內溶液。

2.8.2 重復2.8.1步驟再次漂洗一次。

2.9 洗脫：

2.9.1 將純化柱轉移到一干凈1.5 ml離心管中，加入30-50 μl非變性洗脫液，輕彈混勻，4℃ 2000 rpm 1分鐘，1.5ml離心管內即為純化的目的蛋白；

2.9.2重復2.9.1再次洗脫一次。

2.10 收集：

收集兩次洗脫液即為純化的目的蛋白，-20℃或-80℃貯存。

● 實(shí)驗示例：

非變性條件下His-tag蛋白純化

電泳條件：1×TGS，4-20% RealPAGE Precast Gel 150V 60min

M1：RTD6105 雙色預染寬分子量蛋白Marker（10-170 kD）

M2：RTD6111 寬分子量蛋白Marker（10-200 kD）

未誘導對照（步驟1.4）；IPTG誘導對照（步驟1.6 ）；

               離心后上清（步驟3.5 ）；流穿液FT（步驟3.7.2）； 

               漂洗液1 （W1）（步驟3.8.1 ）；漂洗液2 （W2）（步驟3.8.2 ）；

               洗脫液1（E1）（步驟3.9.1）； 洗脫液2（E2）（步驟3.9.2）