超低分子量蛋白電泳試劑盒（非變性）（貨號：RTD6121）
● 產(chǎn)品組成：
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組分貨號
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組分
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名稱(chēng)
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規格
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貯存
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運輸
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RTD6121-01
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組分1
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2×多肽電泳濃縮膠緩沖液
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15 ml
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4℃
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常溫
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RTD6121-02
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組分2
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2×多肽電泳分離膠緩沖液
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30 ml
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4℃
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常溫
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RTD6121-03
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組分3
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2×PAA溶液 超低濃縮膠用
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15 ml
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4℃
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常溫
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RTD6121-04
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組分4
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2×PAA溶液 超低分離膠用
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30 ml
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4℃
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常溫
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AP020P
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組分5
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10% APS（干粉）
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5 ml
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常溫
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常溫
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TA0761-01
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組分6
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TEMED
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0.5 ml
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常溫
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常溫
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CB020P
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組分7
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10×Tris-Tricine電泳緩沖液 (10×TT)
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500 ml（干粉）
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常溫
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常溫
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TP070
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組分8
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2×Tricine 上樣緩沖液（非變性，非還原）
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1 ml
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-20℃
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常溫
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RTD6202-02
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組分9
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FastBlue蛋白染色液
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500 ml
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常溫
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常溫
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
本試劑盒含有超低分子量蛋白電泳（多肽電泳）全套試劑，可以用來(lái)檢測非變性條件下1-20 kd的多肽大小。本試劑盒可配制至少10塊常規大小的PAGE膠（8×10cm）。具有以下特點(diǎn)：
1 配套試劑不含任何變性劑如SDS和還原劑如DTT或巰基乙醇，適用于非變性電泳。
注：凝膠和電泳緩沖液pH在8.3左右，非變性電泳適于檢測等電點(diǎn)小于8.3的蛋白，等電點(diǎn)近似或大于8.3的堿性蛋白不適合檢測。
2 分辨率高：凝膠緩沖液獨特配方，可以有效分離1-5 kD多肽。
3 使用方便：配制凝膠時(shí)只需1:1混合2×凝膠緩沖液和2×PAA溶液，加上APS和TEMED即可配制凝膠。
● 貯存和效期：
按照標簽溫度貯存；開(kāi)封后有效期一年。
● 使用說(shuō)明：
一. 10% APS配制：
10% APS配制-5 ml：將APS干粉溶于5 ml滅菌水中，徹底溶解后分裝，1 ml/支，-20℃備存，每次取一管使用。10% APS應盡量減少常溫存放時(shí)間，以防失效。10%APS在4℃有效期為一周，-20℃有效期6個(gè)月。若發(fā)現凝膠聚合時(shí)間延長(cháng)，應考慮更換使用-20度保存的10% APS。
二. 制膠：
I 配制分離膠
1．按照表一將不同體積的成分加入到小燒杯或離心管中混合；立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。
表一 （一塊1 mm mini膠用量）*
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分離膠
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濃縮膠
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18％T /5 ml
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5％T /2 ml
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2×多肽電泳濃縮膠緩沖液
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/
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1 ml
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2×多肽電泳分離膠緩沖液
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2.5 ml
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/
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2×PAA溶液 超低濃縮膠用
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/
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1 ml
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2×PAA溶液 超低分離膠用
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2.5 ml
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/
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10％APS
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25-50 μl**
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20-30 μl
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TEMED
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2.5-5 μl
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2 μl
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注： * 如非必須，不要使用厚度1.5mm的凝膠，盡量使用厚度0.75m和1mm的凝膠，這樣會(huì )減少電泳后染色和脫色的時(shí)間。
** 凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì )延長(cháng)?？梢愿鶕矶臉藴蕳l件調節催化劑的加入量。
表二 凝膠制備凝固時(shí)間表
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環(huán)境溫度
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20℃
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25℃
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分離膠配制
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濃縮膠配制
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分離膠配制
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濃縮膠配制
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分離膠配制量
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5 ml
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-
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5 ml
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-
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濃縮膠配制量
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-
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2 ml
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-
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2 ml
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10%APS
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50 μl
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20 μl
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25 μl
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20 μl
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TEMED
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5 μl
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2 μl
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2.5 μl
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2 μl
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凝固時(shí)間
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5-10 分鐘
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20-30 分鐘
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5-10 分鐘
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20-30 分鐘
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2．在凝膠模具中迅速灌入適量分離膠溶液，然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-3 cm的無(wú)水乙醇層，使凝膠表面保持平整。
3．靜置5-10分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。
II 配制濃縮膠
去除覆蓋在分離膠上的乙醇層，用濾紙將殘留的乙醇吸去。
1．按照表一將不同成分加入到小燒杯或離心管中混合；立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。
2．將梳子插入凝膠內，避免產(chǎn)生氣泡。
3．靜置20-30分鐘待凝膠聚合
三. 電泳：
1. 10×Tris-Tricine緩沖液配制：
將10×Tris-Tricine緩沖液（10×TT）粉末（Cat No：CB020P）置于一干凈的一升燒杯中，加入500ml超純水，徹底攪拌混勻，不要調節pH，即配成500ml 10×TT緩沖液。
表三 1×TT緩沖液配制
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1×TT配制量 500 ml
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1×TT配制量 1000 ml
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10×TT
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50 ml
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100 ml
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超純水
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450 ml
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900 ml
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注：伯樂(lè )Mini
III電泳槽一次電泳使用500ml 1×TT緩沖液。
2. 樣品處理：
待上樣的檢測樣品與2×Tricine上樣緩沖液（非變性，非還原）[Cat No：TP070]等體積混合，不要加熱，上樣。蛋白Marker選擇非變性專(zhuān)用Marker，根據說(shuō)明書(shū)使用。將電泳槽的內槽加滿(mǎn)1×TT緩沖液，輕柔拔出梳子，用1ml移液器將梳孔吹洗干凈，將Marker或蛋白樣品（已經(jīng)過(guò)處理）加入點(diǎn)樣孔，穩壓電泳（表四），至藍色指示前沿至分離膠下沿位置時(shí)即可停止電泳。整個(gè)電泳過(guò)程大約需要2.5-3個(gè)小時(shí)。
表四 多肽電泳條件
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恒電壓
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150V
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起始電流
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60-75mA/板膠
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結束電流
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15-25mA/板膠
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電泳時(shí)間
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2.5-3小時(shí)
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四. 染色（使用組分9-FastBlue蛋白染色液）：
4.1 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，蒸餾水漂洗一次；棄水，加入適量染色液（以剛
剛覆蓋過(guò)膠面為適），條帶1-2分鐘即可見(jiàn)。
4.2 搖床上常溫搖動(dòng)10-15分鐘至條帶清晰；觀(guān)察結果。