pfu DNA聚合酶

pfu DNA Polymerase是嗜熱古細菌來(lái)源的DNA聚合酶，該酶除具有5’-3’DNA聚合酶活性外，還具有很強的3’-5’外切酶活性，增強了PCR擴增的保真度。與Taq酶相比，pfu聚合酶熱穩定性更好，更能忍耐較高的變性溫度。Pfu的保真性是Taq DNA聚合酶的10-15倍。延伸速度為0.5kb/分鐘。PCR產(chǎn)物3’端不帶堿基A，為平滑末端，要通過(guò)平滑末端克隆法進(jìn)行克隆。

● 產(chǎn)品組成（RTH3102-02）

pfu DNA Polymerase（2.5U/μl） 40μl

10×pfu PCR buffer（含Mg²^＋） 0.5 ml

● 活性定義

1單位(U) pfu DNA Polymerase活力定義為在74℃、30分鐘內，以活性化的大馬哈魚(yú)精子DNA作為模板/引物，將10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質(zhì)所需的酶量。

● 酶貯存緩沖液

50 mM Tris-HCl (pH 8.0);0.1 mMEDTA;1 mMDTT;50 mMKCl ; Stabilizers; 50% glycerol

● 適用范圍

高保真的DNA片段的擴增、DNA片段的平滑化。

● 使用說(shuō)明：

1. 按照下表在0.2ml PCR管中制備反應體系：

成分	20μl反應體系	50μl反應體系	終濃度
Template	0.04-0.2 μg	0.1-0.5 μg	as you wish
Primer 1（10 μM）	0.4 μl	1 μl	0.2 μM
Primer 2（10μM）	0.4 μl	1 μl	0.2 μM
10×pfu PCR buffer(含Mg²⁺)	2 μl	5 μl	1×
dNTP Mixture(10 mM)	0.4 μl	1 μl	200 μM each
pfu (2.5 U/μl)	0.4 μl	1 μl	0.05U/μl
ddH₂O	up to 20 μl	up to 50 μl	-

注1：如果需要改變Mg²⁺濃度，根據下表調節

PCR反應體系中Mg²⁺終濃度	2 mM	2.5 mM	3 mM	4 mM
20μl反應體系中25 mM MgSO₄加入量	0 μl	0.4 μl	0.8 μl	1.6 μl
50μl反應體系中25 mM MgSO₄加入量	0 μl	1 μl	2 μl	4 μl

注2：配制反應液時(shí)，請最后加入pfu，因為本酶有很強的3’-5’外切酶活性，有可能降解引物。

2. 混勻后，離心快甩將反應液收集到管底。

3. PCR儀如果沒(méi)有熱蓋加熱的話(huà)，補加25μl礦物油。

4. PCR儀上執行以下程序：

步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數
初始變性	94℃	3-5 min	1
變性	94℃	30 sec	25-40*
退火	50-60℃*	30 sec
延伸	72℃	0.5kb/min*
最后延伸	72℃	5 min	1

*注： PCR 反應條件視模板、引物等的結構條件不同而各異。在實(shí)際操作中需根據模板、目的片段的大小、堿基序列和引物的長(cháng)短等具體情況，設定最佳的反應條件（溫度、時(shí)間等）。

● 注意事項

1. pfu 酶具有 3’-5’的外切酶活性，所以 pfu 酶擴增時(shí)延伸速度遠比 Taq 酶低，應根據擴增產(chǎn)物的長(cháng)度設置相應的延伸時(shí)間，一般情況下 pfu 酶的延伸速度為每分鐘 0.5kb；同時(shí) pfu 酶的 3’-5’的外切酶活性可能降解引物，所以應最后把pfu 酶到反應體系中，并立即進(jìn)行 PCR 反應。

2. pfu 酶的熱穩定性比 Taq 酶好，對于 GC 含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃，對 pfu 酶的活性無(wú)影響。

● 使用舉例：

水稻基因組做模板

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