Long Taq DNA Polymerase
長(cháng)片段DNA聚合酶
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目錄號
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濃度
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包裝
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RTL3102-02
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5 U/μl
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500 U （100μl）
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RTL3102-03
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5 U/μl
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5×500 U（5×100μl）
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● 貯存
-20℃保存一年。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Long
Taq DNA Polymerase是由pfu DNA Polymerase和Taq DNA聚合酶按照一定的比例混合而成。兩種酶協(xié)同作用實(shí)現了擴增效率、合成速度和延伸性能的完美統一，在長(cháng)片段PCR反應中具有獨特的優(yōu)勢，可以合成超長(cháng)的DNA片段。另外，此酶具有比Taq
DNA聚合酶約5倍的PCR可信度。該酶的大多數PCR產(chǎn)物3’端帶堿基A，可以通過(guò)TA克隆法進(jìn)行克隆。
● 產(chǎn)品組成（RTL3102-02）
Long Taq DNA Polymerase（5U/μl） 100μl
10×Long Taq PCR
buffer（含Mg2＋） 1ml
2×GC
buffer
2×1 ml
產(chǎn)品組成（RTL3102-03）
Long Taq DNA Polymerase（5U/μl）
5×100μl
10×Long Taq PCR
buffer（含Mg2＋） 5×1ml
2×GC
buffer
10×1 ml
● 活性定義
1單位(U)
Taq DNA Polymerase活力定義為在74℃、30分鐘內，以活性化的大馬哈魚(yú)精子DNA作為模板/引物，將10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質(zhì)所需的酶量。
● 酶貯存緩沖液
50
mM Tris-HCl (pH 8.0);0.1
mMEDTA;1 mMDTT;50 mMKCl ;
Stabilizers; 50% glycerol
● 適用范圍
短鏈和長(cháng)鏈DNA擴增，特別適合于長(cháng)片段DNA的擴增。
● 使用說(shuō)明：
1.
按照下表在0.2ml
PCR管中制備反應體系：
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成分
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體積
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終濃度
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Template
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0.1-1μg
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as you wish
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Primer 1（10
μM）
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1μl
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200nM
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Primer 2（10
μM）
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1μl
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200nM
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10×Long Taq PCR buffer
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5μl
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1×
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dNTP Mixture(10 mM)
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1μl
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200μM each
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Long Taq (5 U/μl)
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0.5-1μl
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2.5-5U
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ddH2O
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up to 50μl
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-
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2.
混勻后，離心快甩將反應液收集到管底。
3.
PCR儀如果沒(méi)有熱蓋加熱的話(huà)，補加25μl礦物油。
4.
PCR儀上執行以下程序：
三步法：
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步驟
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溫度
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時(shí)間
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循環(huán)數
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初始變性
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94℃
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1-5 min
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1
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變性
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94℃
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30 sec
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25-40*
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退火
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Tm-5℃*
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30 sec
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延伸
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72℃
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1 min/kb
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最后延伸
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72℃
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5 min
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1
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兩步法：
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步驟
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溫度
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時(shí)間
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循環(huán)數
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初始變性
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94℃
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1-5 min
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1
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變性
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94℃
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30 sec
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25-40*
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退火和延伸
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68℃
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1 min/kb
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最后延伸
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72℃
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5 min
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1
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*注： PCR 反應條件視模板、引物等的結構條件不同而各異。在實(shí)際操作中需根據模板、目的片段的大小、堿基序列和引物的長(cháng)短等具體情況，設定最佳的反應條件（溫度、時(shí)間等）。
● 使用舉例：
以λ
DNA為模板，配合10×Long Taq PCR buffer，可以很好擴增20kb DNA片段。
以水稻基因組做模板，配合10×Long Taq PCR buffer可以很好擴增PEPCase 5.2kb DNA片段。
● 常見(jiàn)問(wèn)題：
Q1： Long Taq DNA polymerase能擴增多長(cháng)片段？
A1：對簡(jiǎn)單模板（如λ噬菌體做模板），可以擴增20kb片段；對復雜模板（如基因組DNA），可以擴增8kb片段。
Q2：Long
Taq DNA polymerase保真性怎樣？
A2：Long Taq含有3’-5’校對活性的聚合酶，有校對功能。保真性為普通Taq酶的5倍。
Q3：
Long Taq DNA polymerase是否只能擴增長(cháng)片段？
A3：Long Taq也能很好的擴增低于5kb的片段，只是在長(cháng)片段擴增中更有優(yōu)勢。
Q4：進(jìn)行長(cháng)片段PCR時(shí)，為什么推薦使用2階段溫度PCR法？
A4：長(cháng)片段PCR擴增時(shí)要設計比較長(cháng)的引物，以增加引物的特異性，而長(cháng)引物的Tm比較高。在進(jìn)行長(cháng)片段PCR時(shí)，退火溫度和延伸溫度間的差距很小，當退火溫度超過(guò)60℃時(shí)，退火溫度和延伸溫度可以設定為一個(gè)溫度，一般為68℃，這樣進(jìn)行2階段溫度PCR，在長(cháng)片段PCR中能得到更好的效果。
Q5：使用Long
Taq DNA polymerase的擴增產(chǎn)物是否可以進(jìn)行TA克??？
A5：由于使用Long Taq得到的PCR產(chǎn)物大多數帶有A，可以進(jìn)行TA克隆。然而，如果想提高TA克隆的連接效率，建議加A后再進(jìn)行TA克隆。
Q6：Long
Taq DNA polymerase可以擴增高GC含量片段嗎？
A6：要擴增高GC含量片段，建議使用Long Taq配合2×GC buffer使用；不建議使用10×Long Taq buffer。