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2×SYBR qPCR MasterMix

2×SYBR qPCR MasterMix

產(chǎn)品編號:RTQ3101-02

產(chǎn)品規格:1ml

相關(guān)規格:
數量
價(jià)格 ¥300


2×SYBR qPCR MasterMixUniversal

 產(chǎn)品包裝: 

 

組成

RTQ3101-02

(可做4050 μl反應)

RTQ3101-03

(可做20050 μl反應)

RTQ3101-04

(可做100050 μl反應)

長(cháng)期貯存

2×SYBR qPCR MasterMix

1ml

5×1ml

25×1ml

-20℃

RNase-free water

1 ml

5×1 ml

25×1 ml

-20

 






注:以50μl qPCR反應體系為例,每次使用25 μl 2×MasterMix,1 ml可做40 50μl qPCR反應。

 儲存條件: -20℃避光保存;經(jīng)常使用時(shí),一旦融化后請4℃貯存,4℃保存至少3個(gè)月;盡量避免反復凍融。

 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

本制品是采用SYBR® Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real Time PCR的專(zhuān)用試劑。已經(jīng)將 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊穩定劑、優(yōu)化的反應緩沖液和 SYBR® Green I 等試劑預混成一種適合 Real Time PCR反應檢測用 2×MasterMix試劑,具有靈敏度高、特異性強、穩定性好等特點(diǎn)。

本制品使用新型抗體修飾的 HotStart Taq DNA聚合酶,并結合精心優(yōu)化的反應 Buffer,從而有效抑制低溫下的非特異性擴增,提高反應特異性和擴增效率,能夠在更寬廣的范圍內進(jìn)行準確定量。使用時(shí)只需加入模板、引物和水,便可在寬廣的定量區域內得到良好的標準曲線(xiàn),對目的基因進(jìn)行準確定量檢測,重復性好,可信度高。

預混液中含有優(yōu)化的校正染料,與一系列qPCR設備兼容,包括需要ROX校正的儀器,實(shí)驗操作過(guò)程中不需要額外添加校準染料來(lái)校正儀器。

 注意事項

1. 本制品中已經(jīng)含有優(yōu)化的校正染料,客戶(hù)無(wú)需再添加校正染料,可以直接使用。

2. 本制品含SYBR® Green I,強光下易分解,使用時(shí)避免長(cháng)時(shí)間強光照射本制品。

3. 建議在冰上配制qPCR反應液,再放入qPCR儀器中擴增??梢蕴岣邤U增特異性,減少背景。

4.-20℃下保存時(shí)間較長(cháng),有微量沉淀產(chǎn)生,充分混勻后不影響使用。本制品已經(jīng)優(yōu)化了反應緩沖液中的Mg2+濃度,無(wú)需再調節M(mǎn)g2+濃度。

5. 模板DNA:用本產(chǎn)品,cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA等都可作為模板。在添加DNA模板時(shí)請注意模板量對PCR擴增的影響。本產(chǎn)品建議添加量為:cDNA添加量不應超過(guò)總反應體系的10%;基因組DNA為模板時(shí),為避免在高濃度區域出現線(xiàn)性差的情況,請注意添加量小于500 ng;病毒DNA也可作為PCR模板,添加時(shí)請以300 ng為上限;由于質(zhì)粒DNA濃度和拷貝數很高,在添加PCR模板之前最好進(jìn)行稀釋梯度試驗,以便確定合適的質(zhì)粒DNA拷貝數。

6. 引物:

建議每條引物工作濃度200 nM-800 nM;為得到高靈敏度定量性的數據,引物的設計非常重要。以下列舉了設計引物時(shí)需注意的一般事項。

a) 引物長(cháng)度請設定為18bp~30bp、GC含量為40%~65%;

b) 擴增片段一般小于300bp,請盡量設定在80bp~150bp。過(guò)長(cháng)的片段容易導致擴增效率降低;

c) 如設計mRNA為目的片段的引物,設計應盡量橫跨內含子,以防止基因組DNA的擴增而引起假陽(yáng)性;

d) 請盡量選擇Tm為65℃~67℃;

e) A、G、C、T整體分布盡量均勻。不要有部分的GC rich或AT rich(特別是3'端)。避開(kāi)T/C(Polypyrimidine)或A/G(Polypurine)的連續結構;

f) 避開(kāi)引物內部或兩條引物之間有3個(gè)堿基以上的互補序列。二條引物間的3'末端避開(kāi)有2個(gè)堿基以上的互補序列;

g) 引物設計完成后要使用BLAST檢索確認引物的特異性。

此外,引物的純化純度對反應特異性有很大的影響。經(jīng)過(guò)一般純化、純度較低的引物熒光強度散亂,容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物,致使熔解曲線(xiàn)出現雜峰。請盡可能使用HPLC級別純化,至少要用經(jīng)Cartridge(OPC)級別以上純化的引物。

7. 對照設計:

1)No template control(NTC):在qPCR反應體系中僅僅缺少模板。用以檢測有無(wú)二聚體和試劑有無(wú)污染。

2)Reverse Transcripase control:用以評估逆轉錄反應中有無(wú)基因組DNA的污染。在逆轉錄反應中僅僅不含有逆轉錄酶。

●  使用說(shuō)明:

1. 冰浴中徹底融化2×qMasterMix,避免渦旋震蕩,以免產(chǎn)生過(guò)多氣泡,徹底混勻后快甩離心將溶液收集到管底。

2. 按照下表在制備反應體系:

 

50 μl反應體系

20 μl反應體系

終濃度

2×qPCR MasterMix

25 μl

10 μl

上游引物 10 μM

1 μl

0.4 μl

0.2 μM

下游引物 10 μM

1 μl

0.4 μl

0.2 μM

模板

× μl

x μl

10pg-100ng

補至50 μl

補至20 μl

 

3. 快甩離心將反應液收集到管底。

4. 檢測片段大于300 bp,qPCR儀上推薦執行以下程序(三步法):

步驟

溫度

時(shí)間

循環(huán)數

初始變性

95

30 sec*

1

變性

95

15 sec

40

退火

55-65

30 sec

延伸

72

30 sec

熔解曲線(xiàn)

使用機器默認采集程序

檢測片段小于300 bp,qPCR儀上推薦執行以下程序(兩步法):

步驟

溫度

時(shí)間

循環(huán)數

初始變性

95

30 sec*

1

變性

95

15 sec

40

退火和延伸

60

60 sec

熔解曲線(xiàn)

使用機器默認采集程序

注:由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是經(jīng)過(guò)抗體修飾的,初始變性95℃30 sec即可。

 實(shí)驗結果分析

反應結束后加做融解曲線(xiàn),以區分擴增產(chǎn)物及引物二聚體。根據擴增曲線(xiàn)和融解解曲線(xiàn)結果可進(jìn)行PCR定量標準曲線(xiàn)的制作。

 常見(jiàn)問(wèn)題及處理

問(wèn)題

可能原因

推薦的解決方法

無(wú)擴增曲線(xiàn)且無(wú)擴增產(chǎn)物(凝膠電泳)

反應體系中有PCR反應抑制劑

更換或純化模板DNA。

引物設計不合理

重新設計、合成引物。

逆轉錄產(chǎn)物體積過(guò)量

減少逆轉錄產(chǎn)物量以不超過(guò)反應體系的10%。

加樣錯誤或有試劑未加

檢查是否加了所有的所需試劑。

引物的降解

通過(guò)PAGE電泳檢測引物完整性。

退火溫度不正確

優(yōu)化退火溫度。

無(wú)擴增曲線(xiàn)但有擴增產(chǎn)物(凝膠電泳)

qPCR儀設置不正確

檢查dye selction,reference dye是否選擇正確

失效的熒光檢測

熒光檢測應在PCR循環(huán)的退火/延伸階段。

熒光PCR儀問(wèn)題

參考qPCR儀器說(shuō)明書(shū)

陰性對照(NTC)有擴增曲線(xiàn)

 

反應體系中有污染

qPCR片段較小,極易造成環(huán)境中氣溶膠污染。如果融解曲線(xiàn)分析,解鏈溫度和目的片段相同,凝膠電泳中NTC中的片段大小和目的片段相同,極有可能是反應體系中某一或某些試劑污染所引起的。建議換至沒(méi)有污染源的環(huán)境進(jìn)行PCR體系的配制。

引物二聚體

進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析,如果擴增曲線(xiàn)的解鏈溫度小于80,凝膠電泳片段大小和目的片度不符。請重新設計引物。

提高退火溫度3。

PCR效率高于110%

(斜率>-3.1

有非特異性擴增

溶解曲線(xiàn)分析非特異性擴增;優(yōu)化引物設計

PCR擴增效率低于90%

(斜率<-3.6)

反應體系中有PCR反應抑制劑

更換或純化模板DNA

PCR擴增條件不合適引起擴增效率降低。

確認引物濃度。注意qPCR Master Mix是否失效。

引物設計

重新設計引物,避免擴增區域的DNA二級結構。

實(shí)時(shí)熒光曲線(xiàn)線(xiàn)性不好

模板DNA含量較低或過(guò)高

應調整樣品的DNA濃度。

模板DNA中含有抑制PCR擴增反應的物質(zhì)

對模板DNA進(jìn)行純化或更換模板。

 

 

質(zhì)量不好的逆轉錄試劑盒合成的cDNA,逆轉錄反應液中所含的物質(zhì)可能抑制PCR反應。

請降低樣品濃度,或將樣品純化后再進(jìn)行反應。建議使用品牌質(zhì)量較好的cDNA合成逆轉錄試劑盒。

CT值高于預期值

加入的模板量太少

適當增加模板量。

樣品被降解

檢查樣品的完整性。

引物不合適

重新設計合成引物。

CT值低于預期值

加入了過(guò)多的模板

減少模板量。

PCR產(chǎn)物太長(cháng)

一般采用100-150bp的產(chǎn)物長(cháng)度,一般不超過(guò)500bp

CT值的標準差>0.16

取樣不準確

每種樣品的反應混合液?jiǎn)为毰渲?,充分混勻?/span>

qPCR之前要離心,管壁不要沾有反應液。

ΔRn值太小

PCR效率太低

優(yōu)化PCR反應條件。

目標模板數太低

增加模板量。

擴增曲線(xiàn)的熒光信號弱,或擴增曲線(xiàn)呈鋸齒狀

 

PCR的延伸時(shí)間過(guò)短即熒光讀取時(shí)間不充分,熒光收集不能充分完成。

適當增加延伸時(shí)間。

以少于PCR儀器標準條件的反應體積進(jìn)行擴增,熒光收集量的誤差會(huì )增大

應增加反應體積以滿(mǎn)足PCR儀器標準。

 




 
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