2×SYBR qPCR MasterMix（Universal）
● 產(chǎn)品包裝：
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組成
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RTQ3101-02
(可做40次50 μl反應)
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RTQ3101-03
(可做200次50 μl反應)
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RTQ3101-04
(可做1000次50 μl反應)
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長(cháng)期貯存
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2×SYBR qPCR MasterMix
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1ml
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5×1ml
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25×1ml
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-20℃
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RNase-free water
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1 ml
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5×1 ml
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25×1 ml
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-20℃
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注：以50μl qPCR反應體系為例，每次使用25 μl 2×MasterMix，1 ml可做40次 50μl qPCR反應。
● 儲存條件: -20℃避光保存；經(jīng)常使用時(shí)，一旦融化后請4℃貯存，4℃保存至少3個(gè)月；盡量避免反復凍融。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
本制品是采用SYBR® Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real Time PCR的專(zhuān)用試劑。已經(jīng)將 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊穩定劑、優(yōu)化的反應緩沖液和 SYBR® Green I 等試劑預混成一種適合 Real Time PCR反應檢測用 2×MasterMix試劑，具有靈敏度高、特異性強、穩定性好等特點(diǎn)。
本制品使用新型抗體修飾的 HotStart Taq DNA聚合酶，并結合精心優(yōu)化的反應 Buffer，從而有效抑制低溫下的非特異性擴增，提高反應特異性和擴增效率，能夠在更寬廣的范圍內進(jìn)行準確定量。使用時(shí)只需加入模板、引物和水，便可在寬廣的定量區域內得到良好的標準曲線(xiàn)，對目的基因進(jìn)行準確定量檢測，重復性好，可信度高。
預混液中含有優(yōu)化的校正染料，與一系列qPCR設備兼容，包括需要ROX校正的儀器，實(shí)驗操作過(guò)程中不需要額外添加校準染料來(lái)校正儀器。
● 注意事項
1. 本制品中已經(jīng)含有優(yōu)化的校正染料，客戶(hù)無(wú)需再添加校正染料，可以直接使用。
2. 本制品含SYBR® Green I，強光下易分解，使用時(shí)避免長(cháng)時(shí)間強光照射本制品。
3. 建議在冰上配制qPCR反應液，再放入qPCR儀器中擴增?？梢蕴岣邤U增特異性，減少背景。
4.-20℃下保存時(shí)間較長(cháng)，有微量沉淀產(chǎn)生，充分混勻后不影響使用。本制品已經(jīng)優(yōu)化了反應緩沖液中的Mg2+濃度，無(wú)需再調節M(mǎn)g2+濃度。
5. 模板DNA：用本產(chǎn)品，cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA等都可作為模板。在添加DNA模板時(shí)請注意模板量對PCR擴增的影響。本產(chǎn)品建議添加量為：cDNA添加量不應超過(guò)總反應體系的10%；基因組DNA為模板時(shí)，為避免在高濃度區域出現線(xiàn)性差的情況，請注意添加量小于500 ng；病毒DNA也可作為PCR模板，添加時(shí)請以300 ng為上限；由于質(zhì)粒DNA濃度和拷貝數很高，在添加PCR模板之前最好進(jìn)行稀釋梯度試驗，以便確定合適的質(zhì)粒DNA拷貝數。
6. 引物：
建議每條引物工作濃度200 nM-800 nM；為得到高靈敏度定量性的數據，引物的設計非常重要。以下列舉了設計引物時(shí)需注意的一般事項。
a) 引物長(cháng)度請設定為18bp～30bp、GC含量為40%～65%；
b) 擴增片段一般小于300bp，請盡量設定在80bp～150bp。過(guò)長(cháng)的片段容易導致擴增效率降低；
c) 如設計mRNA為目的片段的引物，設計應盡量橫跨內含子，以防止基因組DNA的擴增而引起假陽(yáng)性；
d) 請盡量選擇Tm為65℃～67℃；
e) A、G、C、T整體分布盡量均勻。不要有部分的GC rich或AT rich（特別是3'端）。避開(kāi)T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的連續結構；
f) 避開(kāi)引物內部或兩條引物之間有3個(gè)堿基以上的互補序列。二條引物間的3'末端避開(kāi)有2個(gè)堿基以上的互補序列；
g) 引物設計完成后要使用BLAST檢索確認引物的特異性。
此外，引物的純化純度對反應特異性有很大的影響。經(jīng)過(guò)一般純化、純度較低的引物熒光強度散亂，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，致使熔解曲線(xiàn)出現雜峰。請盡可能使用HPLC級別純化，至少要用經(jīng)Cartridge(OPC)級別以上純化的引物。
7. 對照設計：
1）No template control（NTC）：在qPCR反應體系中僅僅缺少模板。用以檢測有無(wú)二聚體和試劑有無(wú)污染。
2）Reverse Transcripase control：用以評估逆轉錄反應中有無(wú)基因組DNA的污染。在逆轉錄反應中僅僅不含有逆轉錄酶。
● 使用說(shuō)明：
1. 冰浴中徹底融化2×qMasterMix，避免渦旋震蕩，以免產(chǎn)生過(guò)多氣泡，徹底混勻后快甩離心將溶液收集到管底。
2. 按照下表在制備反應體系：
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50 μl反應體系
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20 μl反應體系
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終濃度
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2×qPCR MasterMix
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25 μl
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10 μl
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1×
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上游引物 10 μM
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1 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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下游引物 10 μM
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1 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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模板
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× μl
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x μl
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10pg-100ng
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水
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補至50 μl
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補至20 μl
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3. 快甩離心將反應液收集到管底。
4. 檢測片段大于300 bp，qPCR儀上推薦執行以下程序（三步法）：
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步驟
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溫度
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時(shí)間
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循環(huán)數
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初始變性
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95℃
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30 sec*
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1
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變性
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95℃
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15 sec
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40
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退火
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55-65℃
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30 sec
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延伸
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72℃
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30 sec
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熔解曲線(xiàn)
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使用機器默認采集程序
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檢測片段小于300 bp，qPCR儀上推薦執行以下程序（兩步法）：
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步驟
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溫度
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時(shí)間
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循環(huán)數
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初始變性
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95℃
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30 sec*
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1
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變性
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95℃
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15 sec
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40
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退火和延伸
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60℃
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60 sec
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熔解曲線(xiàn)
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使用機器默認采集程序
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注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是經(jīng)過(guò)抗體修飾的，初始變性95℃30 sec即可。
● 實(shí)驗結果分析
反應結束后加做融解曲線(xiàn)，以區分擴增產(chǎn)物及引物二聚體。根據擴增曲線(xiàn)和融解解曲線(xiàn)結果可進(jìn)行PCR定量標準曲線(xiàn)的制作。
● 常見(jiàn)問(wèn)題及處理
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問(wèn)題
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可能原因
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推薦的解決方法
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無(wú)擴增曲線(xiàn)且無(wú)擴增產(chǎn)物（凝膠電泳）
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反應體系中有PCR反應抑制劑
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更換或純化模板DNA。
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引物設計不合理
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重新設計、合成引物。
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逆轉錄產(chǎn)物體積過(guò)量
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減少逆轉錄產(chǎn)物量以不超過(guò)反應體系的10%。
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加樣錯誤或有試劑未加
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檢查是否加了所有的所需試劑。
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引物的降解
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通過(guò)PAGE電泳檢測引物完整性。
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退火溫度不正確
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優(yōu)化退火溫度。
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無(wú)擴增曲線(xiàn)但有擴增產(chǎn)物（凝膠電泳）
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qPCR儀設置不正確
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檢查dye selction，reference dye是否選擇正確
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失效的熒光檢測
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熒光檢測應在PCR循環(huán)的退火/延伸階段。
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熒光PCR儀問(wèn)題
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參考qPCR儀器說(shuō)明書(shū)
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陰性對照（NTC）有擴增曲線(xiàn)
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反應體系中有污染
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qPCR片段較小，極易造成環(huán)境中氣溶膠污染。如果融解曲線(xiàn)分析，解鏈溫度和目的片段相同，凝膠電泳中NTC中的片段大小和目的片段相同，極有可能是反應體系中某一或某些試劑污染所引起的。建議換至沒(méi)有污染源的環(huán)境進(jìn)行PCR體系的配制。
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引物二聚體
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進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析，如果擴增曲線(xiàn)的解鏈溫度小于80℃，凝膠電泳片段大小和目的片度不符。請重新設計引物。
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提高退火溫度3℃。
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PCR效率高于110%
(斜率>-3.1）
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有非特異性擴增
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溶解曲線(xiàn)分析非特異性擴增；優(yōu)化引物設計
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PCR擴增效率低于90%
(斜率<-3.6)
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反應體系中有PCR反應抑制劑
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更換或純化模板DNA
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PCR擴增條件不合適引起擴增效率降低。
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確認引物濃度。注意qPCR Master Mix是否失效。
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引物設計
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重新設計引物，避免擴增區域的DNA二級結構。
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實(shí)時(shí)熒光曲線(xiàn)線(xiàn)性不好
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模板DNA含量較低或過(guò)高
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應調整樣品的DNA濃度。
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模板DNA中含有抑制PCR擴增反應的物質(zhì)
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對模板DNA進(jìn)行純化或更換模板。
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質(zhì)量不好的逆轉錄試劑盒合成的cDNA，逆轉錄反應液中所含的物質(zhì)可能抑制PCR反應。
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請降低樣品濃度，或將樣品純化后再進(jìn)行反應。建議使用品牌質(zhì)量較好的cDNA合成逆轉錄試劑盒。
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CT值高于預期值
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加入的模板量太少
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適當增加模板量。
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樣品被降解
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檢查樣品的完整性。
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引物不合適
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重新設計合成引物。
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CT值低于預期值
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加入了過(guò)多的模板
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減少模板量。
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PCR產(chǎn)物太長(cháng)
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一般采用100-150bp的產(chǎn)物長(cháng)度，一般不超過(guò)500bp
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CT值的標準差>0.16
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取樣不準確
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每種樣品的反應混合液?jiǎn)为毰渲?，充分混勻?/span>
qPCR之前要離心，管壁不要沾有反應液。
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ΔRn值太小
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PCR效率太低
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優(yōu)化PCR反應條件。
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目標模板數太低
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增加模板量。
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擴增曲線(xiàn)的熒光信號弱，或擴增曲線(xiàn)呈鋸齒狀
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PCR的延伸時(shí)間過(guò)短即熒光讀取時(shí)間不充分，熒光收集不能充分完成。
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適當增加延伸時(shí)間。
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以少于PCR儀器標準條件的反應體積進(jìn)行擴增，熒光收集量的誤差會(huì )增大
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應增加反應體積以滿(mǎn)足PCR儀器標準。
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