Reverse Transcriptase
M-MLV（RNase H-）
M-MLV反轉錄酶(RNase缺失)
● 產(chǎn)品貨號及規格：
|
貨號
|
名稱(chēng)
|
濃度
|
包裝
|
貯存
|
|
RTR2102-01
|
Reverse Transcriptase
M-MLV
（RNase H-）
|
200U/μl
|
2000U
|
-20℃
|
|
RTR2102-02
|
5×RT buffer
|
5×
|
0.2 ml
|
-20℃
|
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
M-MLV反轉錄酶(RNase H-)，是一種經(jīng)過(guò)改造和優(yōu)化的反轉錄酶。和普通的M-MLV反轉錄酶相比，缺失了Ribonuclease H (RNase H)酶活性，不能夠選擇性剪切RNA和DNA雜合雙鏈中的RNA，可以合成長(cháng)片段從DNA。
本產(chǎn)品中M-MLV反轉錄酶(RNase H-)的濃度為200 U/μl，用于體積為20微升的反轉錄體系時(shí)足夠進(jìn)行10次反轉錄反應。
特點(diǎn)：M-MLV反轉錄酶(RNase
H-)可以合成長(cháng)達9-13kb的cDNA。該反轉錄酶的最適反應溫度為42-45℃并且在55℃時(shí)仍然有很高活性，可以避免普通的M-MLV反轉錄酶(RNase
H-)在37℃反應時(shí)的一些不足。
用途：M-MLV反轉錄酶(RNase
H-)常用于在獲得總RNA或mRNA后cDNA第一條鏈的合成。合成的cDNA第一條鏈后續可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二條鏈的合成等。
來(lái)源：該反轉錄酶(RNase
H-)由大腸桿菌表達
活性定義：One unit of the enzyme incorporates 1
nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10 min at37℃.
Enzyme activity is assayed in50 mMTris-HCl (pH 8.3),6 mMMgCl2,10 mMDTT,40 mMKCl,0.5 mMdTTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP0.4 mMpolyA?oligo(dT)12-18.
純度：不含DNA內切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以滿(mǎn)足常規反轉錄合成cDNA第一條鏈等的需要。
酶儲存溶液：50 mMTris, pH 8.3,100mMNaCl,1 mMEDTA,5 mMDTT, 0.1%
Triton X-100 and 50% glycerol。
5×RT buffer：250 mMTris, pH 8.3 at25℃,250 mMKCl,20 mMMgCl2，50mM DTT。
失活或抑制：70℃孵育10分鐘可以導致M-MLV反轉錄酶(RNase
H-)失活；EDTA、EGTA等螯合劑、無(wú)機磷酸鹽或焦磷酸鹽以及聚氨(polyamine)對該反轉錄酶(Rnase H-)有抑制作用。
● 使用說(shuō)明：
cDNA第一鏈合成：
1. 0.2ml PCR管中配制模板/引物變性混合液：
|
加樣順序
|
試劑
|
使用量
|
|
1
|
模板RNA
|
1 ng-1 μg*
|
|
2（后面3種任選一種）
|
Oligo(dT)18 primer(100 μM)
or Random primer(100 μM)
or Specific primer(10 μM)
|
0.5 μl
|
|
3
|
RNase-free 水
|
Up to 6 μl
|
注：* Total RNA 的使用量一般為1 ng-1 μg；mRNA的使用量一般為 10 pg-1 μg。
2.70℃保溫 10 分鐘后迅速在冰上急冷 2 分鐘以上。
注：此步驟是打開(kāi)RNA的一些比較穩定的二級結構。
3. 離心數秒鐘使模板 RNA/引物的變性混合液聚集于離心管底部。
4. 在上述離心管中配制下列反轉錄反應液。
|
加樣順序
|
試劑名稱(chēng)
|
使用量
|
|
1
|
模板/引物變性混合液
|
6 μl
|
|
2
|
5×RT buffer
|
2 μl
|
|
3
|
10mM dNTP
|
0.5 μl
|
|
4（可選）
|
RNase Inhibitor(40U/μl)
|
0.25μl
|
|
5
|
M-MLV(RNaseH-)
|
0.25-1μl*
|
|
6
|
RNase-free 水
|
up to 10μl
|
* 當起始模板 RNA量＞500
ng 時(shí)， M-MLV（RNase
H-）的使用量應＞0.25 μl。
5. 若使用Oligo(dT)18或基因特異性引物，42℃溫育30
min；若使用隨機引物，先30℃溫育5 min，之后42℃溫育30
min；
6. 70℃保溫10分鐘后冰上冷卻，得到的 cDNA溶液可直接用于PCR擴增，PCR擴增時(shí) cDNA溶液的推薦使用量50μl體系加2 μl。
注：cDNA溶液置于-20℃可保存半年；置于-80℃可長(cháng)期儲存。
引用RTR2102 M-MLV(RNase
H-) 反轉錄酶發(fā)表文章
使用該產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：
1. [2018 IF=3.8] High-Throughput
Sequencing Analysis of Small RNAs Derived from Coleus Blumei Viroids
Author: Dong-Mei Jiang , Meng Wang , Shi-Fang Li, Zhi-Xiang
Zhang
Journal: Viruses 2019, 11, 619
Institution：Institute of Plant Protection,Chinese
Academy of Agricultural Sciences
Paper link： https://www.mdpi.com/1999-4915/11/7/619